|
|||||||
|
|
|
|||||
|
|
|||||||
Jan-Christian Wasmutha, Desamparados Oliver y Miñarro, Angela Homrighausen, Ludger Leifeld, Jürgen K. Rockstroh, Tilman Sauerbruch1 and Ulrich Spengler
Department of Internal Medicine I, University of Bonn, Sigmund-Freud-Strasse 25, 53105 Bonn, Germany
Çeviren: Dr. Mehmet UYSAL
Data Supplement Abstract
FOSFOLİPİD OTOANTİKORLARI VE ANTİFOSFOLİPİD ANTİKOR
SENDROMU: ÇALIŞILAN 23 METODUN TANISAL DOĞRULUĞUNUN, KLİNİK BELİRTİLERİN SAYISI
İLE ROC EĞRİLERİNDE MEYDANA GELEN VARYASYON YOLU İLE DEĞERLENDİRİLMESİ
Tekrarlayan arteriyel veya
venöz tromboembolizmler antifosfolipid sendromunun en önemli klinik
belirtileridir ve bunlar çeşitli otoimmun hastalıkların komplikasyonu olarak da
görülebilir. Bununla birlikte olası klinik spektrum çok çeşitlidir ve spontan
abortus, trombositopeni, uzamış kanama zamanı (lupus antikoagülant), livedo
racemosa ve çeşitli nörolojik
semptomları içerir. APS’in endotel ve trombosit membranlarındaki fosfolipid
antijenlerine karşı gelişen otoantikorlar sonucu geliştiği sanılmaktadır.
Klinik prezentasyondaki büyük çeşitlilik ve heterojenite büyük olasılıkla
antikorlardaki heterojeniteyi yansıtmaktadır.
Aktive protrombin, protein C,
protein S, annexin V, faktör XII, trombomodulin ve doku plazminojen aktivatörü
gibi antikoagülatör proteinler ile antikorlar interfere olabilmesine karşın,
antifosfolid antikorları arasında (APS-Ab) bulunan antikardiyolipin antikorları
(aCL) APS ile özellikle ilşkilidir. aCL antikorları 50 kDa büyüklüğünde serum
kofaktörü olan b2 glikoprotein I (b2GPI)
varlığında kardiyolipin ile reaksiyona girer. b2GPI aCL antikorlarının SLE’de kardiyolipine
bağlanmasını arttırmaktadır.
Elde edilen kanıtlar b2GPI’ya
karşı oluşan antikorların APS’ye sebep olan esas kaynak olduğunu
göstermektedir. Bu, klinik uygulamalarda APL-Abs’nın tespitinde hangi antijenin
kullanılması gerektiği konusunda tartışmalara yolaçmıştır. Günümüzde
varılan konsensusa göre APS ilişkili otoantikorların doğru tanımlanmasının
doğru teşhiste az önemli bir faktör olduğu gösterilmiştir. Fakat aCL
otoantikorlarının belirli izotiplerinin farklı klinik belirtilerin varlığı ile
ilişkili olup olmadığı henüz tam açık değildir. Mesela IgA izotipinin özellikle
trombositopeni, deri belirtileri ve trombositik olayların artmış riski ile
ilişkili olduğu öne sürülmektedir. Bununla birlikte diğerlerinin benzer
ilişkileri bulunmamaktadır. Bundan başka IgA-aCL otoantikorlarının prevelansı
farklı etnik kökenlere göre belirgin heterojenite gösterebilmektedir.
APS teşhisinde farklı
APL otoantikorlarının klinik önemini
açıklığa kavuşturmak için, klinik olarak APS olduklarından şüphelenilen 144
Yahudi hastada aCL ve ab2GPI
antikorlarını (hem izotipleri hem de genel olarak) 23 farklı reaktif setiyle ölçtük.
Bu hastalarda klinik durum
standardize edilmiş sorularla belirtilmiştir ve testin kesinliği ROC analizi
ile çalışılmıştır.
APS’un prezentasyonundaki klinik heterojenite ile APL antikorlarının heterojenitesi ve varlığı arasındaki ilişkiyi çalışmak için, APS’un tanısı bu hastalığa ait klinik özelliklerin sayısına göre düzenlenmiştir.
Katılımcılar
Bu çalışma Kasım 96-Ağustos 97 tarihleri arasında APS olduklarından şüphelenilen 160 hastanın serumlarından çalışılmıştır. Kan örnekleri Bonn Üniversitesi Hastanesinin farklı departmanlarından temin edilmiştir; Dahiliye (n=84), Nöroloji (n=31), Dermatoloji (n=17), Jinekoloji (n=21) ve Pediatri (n=7).
Diagnostik standartlardaki farklılıkları hesaba katmak için, hasta verileri yeniden değerlendirilmeye alınmış ve antifosfolipit sendromu, standardize kriterler ve protokol kullanılarak yeniden tanımlanmıştır.
(a) Tekrarlayan
venöz trombozlar (ya ultrasound ya da flebografi ile tespit edilmiş)
(b) Trombositopeni
(< 100 g/L psödotrombositopeniyi ekarte etmek için hem EDTA’lı hem de
sitratlı kanda)
(c) Tekrarlayan
spontan abortus (2’den fazla)
(d) Nörolojik
semptomlar (transiyel iskemik atak ve hemipleji gibi) ve doppler ultrasound,
anjiografi veya MRI anjiografi teyit edilen arteriyel ve venöz oklüzyon
belirtileri
(e) Periferik
arter oklüzyonları (anjiografi veya trombektomi ile doğrulanmış)
(f) Amaurosis
fugax
(g) Livedo
retikülaris
(h) Bacakta
ülserasyon
(i) SLE
veya diğer otoimmün proçesler
(j) Uzamış
aktive parsiyel tromboplastin zamanı (LAC’ın markerı olarak)
16 hastanın verileri eksik
bulunmuş ve analize dahil edilmemiştir. İyi tanımlanan 144 hasta
analize alınmıştır (50 Erkek, 94 Kadın; ortalama yaş ± SD,
44±12).
Bu 144 hastanın 53’ünde klinik özellikler ve APL-Abs’lar ikinci kez
çalışılmıştır.
Bilinen bir hastalığı olmayan, semptomsuz sağlıklı 10 kişinin (3 Erkek, 7 Kadın; ortalama yaş ± SD, 42 ± 14) kan örnekleri negatif kontrol olarak çalışmaya dahil edilmiştir.
Serum örnekleri toplandıktan
sonra –80oC’de dondurulmuştur. aCL ve ab2GPI antikorlarının kanditatif tespiti için 3
ayrı firmaya ait ELISA kullanılmıştır (Tablo 1). Tüm ölçümlerde standart
ELISA prosedürüne uygun olan firmanın kullanma talimatı kullanılmıştır.
Laboratuvarımızda bulunan kalibratörler standardizasyon için kullanılmıştır.
Negatif kontroller negatif test sonuçları sağlamak ve istatistiksel analizde
kullanılmak için ölçüme dahil edilmiştir. Absorbans fotometrede 450nm’de
(Spectra Mini; Tecan) ölçülmüştür. Cutoff değerleri firma tarafından
tanımlanmıştır.
İSTATİSTİKSEL ANALİZ
Herbir ELISA’nın doğruluğunu
nitelendirmek için 2x2 olasılık tablosundan spesifite ve sensitivite hesaplanmıştır
ve ROC eğrisi olarak çizilmiştir. ROC eğrisinin altındaki alan (AUC), W
ve onun standart hatası (SEw), Henley ve McNeil ve Beck ve
Schultz’un metotlarına göre hesaplanmıştır. Her bir ROC eğrisindeki AUC’nin
önemi standart kritik oran testiyle analiz edilmiştir.
|
W –0.5 z = ----------- SEw |
Bu skor testi AUC’nın 0.5’den anlamlı
olarak farklı olmadığı hipotezini test etmektedir ve düz çizgi altında kalan
alan (sensitivite = 1- spesifite) normal ve anormal arasındaki ayrıma olanak
sağlamamaktadır.
İki ROC eğrisindeki (A ve B) AUC’leri istatistiksel olarak karşılaştırmak için kritik z oranı hesaplanmıştır.
|
WA - WB z = ------------------------------- (SEWA)2 – 2r(SEWA SEWB) |
Buradaki r WA ve WB
arasında hesaplanan korelasyonu gösterir. Her iki z-istatistiklerinin sonuçları
P (çift yönlü) olarak verilmiştir. a = 0.05 seviyesindeki
ELISA’lar arasında bulunan anlamlı farklılıkları tespit etmek için Swets ve
Picket’in önerileri göz önüne alınarak numune miktarı belirlenmiştir.
ROC analizi, eşzamanlı bulunan klinik belirti ve semptomların sayısına bağlı farklı APS tanımlamalarına göre tekrar tekrar yapılmıştır.
Hastalar 4 gruba ayrılmıştır
(semptom ve belirtilere bağlı olarak)
Grup I 10 klinik
kriterden 2 veya daha fazlası
Grup II 3 veya
daha fazlası
Grup III 4 veya
daha fazlası
Grup IV 5 veya daha fazlası
Her bir analizde gerekli klinik özellikten daha az sayıya sahip olan hastalar hastalıksız grup olarak 2 x2 olasılık tablosunda yer almışlardır.
İstatistiksel analiz SPSS programı ile yapılmış ve ROC analizi de excel de yapılmıştır.
Klinik
özellikler ve işlenmemiş bilgilerin ROC analizi
Çalışmamızda 144 hastanın;
- 25’inde tekrarlayan venöz
tromboembolizm,
- 21’inde periferal arteriyel
oklüzyon,
- 10’unda bacakta
ülserasyonlar,
- 8’inde livedo retikülaris ve
- 37’sinde iskemik nörolojik semptomlar ve belirtiler (serebral damarlardaki tıkanıklığın radyolojik kanıtları vardır)
27 hastada SLE,
24 hastada trombositopeni ve
9 hastada tespit edilebilir
konsantrasyonda LAC mevcuttur.
Tanımlanan çalışma kriterlerine göre hasta verileri yeniden değerlendirildiğinde 144 hastanın 38’inde bazı objektif APS belirtilerinin hatalı olarak onaylandığı tespit edilmiştir.
APS’nin çeşitli klinik
özelliklerinin eş zamanlı bulunmasına göre;
45 hasta grup
I’de(³2),
20 hasta grup
II’de(³3),
5’inde LAC olan 7 hasta
grup III’de(³4),
4’ünde LAC olan 4 hasta
grup IV ’de (³5) sınıflandırılmıştır.
53 hasta için (ilk serum analizinde 19’unda çok düşük miktarda APS-Abs ve 34’ünde hiç APS-Abs bulunmamaktadır.) İkinci serum analizi farklı bir zamanda analiz edilmiştir. Bununla birlikte bu 53 hastanın hiçbiri ikinci APS-Ab testine göre ya da APS’nin yeni ortaya çıkan özelliklerine farklı gruplara ayrılmamıştır.
İlk ROC analizimizde, LAC’ın
bulunuşu 23 ELISA’nın 10’unda APL-Abs’nin bulunuşu ile anlamlı olarak
ilşkili bulunmuştur.
(aCL antikorları için, IgG ve
IgM A ve B firmasının ELISA’sı, IgA, B
ve C firmasının ELISA’sı,
ab2GPI antikorları için, IgG her 3 firmanın ELISA’sı, IgA B firmasının ELISA’sı
(AUC range: 0.75-0.93, SE range : 0.080-0.109, P range: 0.01-10-4)
IgM izotip antikorlarının
bulunuşu 6 ELISA’nın 5’inde rekürren venöz tromboembolizm ya da
arteriyel oklüzyonlarla anlamlı olarak ilişkili bulunmuştur.
(aCL antikorları için, her 3 firmaya ait ELISA, ab2GPI antikorları için, A ve B firmasına ait ELISA;
AUC range: 0.64-0.76; SE range: 0.049-0.075; P range 0.02-10-4)
Bacaklardaki ülserasyonlarla 2
IgM ELISA anlamlı olarak ilişkili bulunmuştur.
[IgM aCL antikorları için
B firmasına ait ELISA ile) (AUC = 0.67, SE = 0.075, P<0.05); ve IgM ab2GPI
antikorları için A firmasına ait ELISA ile (AUC 0.70; SE:0.091,
P<0.05)].
APS ilişkili fenomenlerle
pozitif antifosfolipit test sonucu arasındaki en iyi ilişki LAC varlığında C
firmasına ait ELISA ile IgG ab2GPI’de
bulunmuştur.
(AUC = 0.93, SE = 0.102, P < 10-4).
Bununla birlikte bu ilişki üretici firma tarafından verilen cutoff değerlerine göre yalnızca % 67 sensitivite ve % 91 spesifiteye sahiptir.
Sonuç olarak bu konudaki
ileri analizlerin odak noktası, çok sayıda APS ilişkili özellikleri bir arada
bulunduran hastaları belirlemek için gerekli ölçümlerin performansını tespit
etmeye yöneliktir.
APS KRITERLERININ SAYISINA GÖRE
YAPILAN GRUPLANDIRMA VE ROC ANALİZİ
ROC karakteristikleri (AUCs) C
firmasına ait aCL antikor testi dışında tüm ölçümlerde APS tanısı için
gerekli kriterlerin sayısına paralel olarak gelişme göstermektedir. 4 veya daha
fazla tipik APS belirtisi olduğu zaman (grup III) ROC eğrisi altındaki alan
> 0.8 olmaktadır.
(Şekil 2)
Firma tarafından sağlanan cutoff değerleri kullanıldığında, grup I ve II’de sensitivite % £ 67 olmaktayken (range % 4-67) grup III ve IV’de sensitivite IgG, IgM ve screen assay için % 100’e ulaşmaktadır (% 33-100). Bu, APS tanısı için kullanılan katı kriterlerin daha az yanlış pozitif sonuçlara yol açtığını göstermektedir.
IgA antikorlarını tespit etmek
için analizi yapılan testler diğer testlerden daha düşük sonuçlar vermiştir.
(aCL, ab2GPI
antikoru olup olmamasına veya spesifite ya da firmaya bakılmaksızın). En iyi
IgA testinde sensitivite % 25’i aşmamaktadır (veriler gösterilmemiştir). C
firmasına ait tüm aCL antikoru testlerinde IgA testleri istatistiksel
analizlere katılmamıştır. Çünkü APS teşhisi için gerekli klinik kriterlerin
sayısına bağlı olan diagnostik doğrulukları düşüktür.
APS’nin klinik önemi yaygın kabul görmüştür. Vasküler trombos ve gebelik kaybı gibi çeşitli semptomlar APS ile ilişkilidir. Bununla beraber bu ilişkinin nasıl meydana geldiği hususu tam olarak anlaşılamamıştır ve heterojen olarak görülmüştür. Muhtemelen bu da APL-Abs’larının heterojenitesini yansıtmaktadır.
Bu çalışmada 23 farklı ELISA kullanarak 144 hastada APL-Abs araştırılmıştır. Antijen preparasyonundaki farklılıkları hesaba katmak için 3 ayrı firmaya ait ölçümleri seçtik. Bu test metotlarının diagnostik doğruluğunu karşılaştırmak için APS tanımlaması için kullanılan diagnostik kriterlerin sayısı ile ROC analizi yapılmıştır.
Ele alınması gereken bir başka
husus, fikse kriterlerin kullanılması, bu nedenle APS gibi geniş bir klinik
belirti spektrumuna sahip hastalıkta yalnızca bu belirtilere sahip hastaların
APS olarak tanımlanmış olmasıdır. Diğer yandan genel düşüncemiz klinik belirtilerin sayısıyla ROC
eğrilerindeki varyasyonların değerlendirilmesinde APS’un hastadan hastaya olan
ekspresyonundaki değişkenliğin de hesaba katılması gerekliliğidir. Diagnostik
kriterlerin sayısı arttıkça test için doğruluğun arttığı ortadadır (C firmasına
ait aCL antikorları hariç).
Yaptığımız analizde neredeyse
mükemmel ROC eğrisinin 4 veya daha fazla özelliğe sahip APS hastalarından elde
edildiğini göstermektedir. Bu plato farklı antijenlerle (aCL ve ab2GPI) ve farklı firmalardan elde edilmiştir. Genel
olarak IgG, IgM veya IgG+IgM (screen) testleri Bertollaccini ve arkadaşlarının
önceki çalışmalarıyla benzer sonuçlar vermiştir. Bununla birlikte grup III ve
Grup IV’deki hastaların sayısı daha düşüktür ve bu yüzden testler arasındaki
istatistiksel olarak anlamlı farkı tespit edebilme şansımız daha
sınırlıdır. C firmasına ait aCL
ölçümündeki sonuçlar beklenmedik bir durum olarak karşımıza çıkmaktadır.
Elde edilen veriler ab2GPI’nin
aCL’den APS ile daha uyumlu bir antikor olabileceğini düşündürmektedir.
Yaptığımız çalışma C şirketi
tarafından imal edilen aCL ölçümünün başarısızlığını, ab2GPI
antikorlarının klinik semptomlarla daha iyi korelasyon gösterdiğini ve aCL
testlerinin tanısal gücünün kontamine ab2GPI
antikorlarının çapraz reaksiyonuna dayandığı görüşünü desteklemektedir. Bu
görüş Day ve Gomez’in son zamanlarda bildirdikleri ile uyumludur. b2GPI
ile kontamine çapraz reaktivite aynı zamanda, b2GPI
testlerinin neden ROC eğrilerinin altındaki alanda bulunduğunu da
açıklamaktadır. (C firmasının aCL’için hariç aCL testleri de böyledir).
IgA izotiplerinde çalışılan
testler, diğer izotip antikorlardan daha az iyidir. Bu bulgu Wilson ve Selva-O’Callaghan’ın
bilgileri ile aynı çizgidedir. Wilson ve Selva-O’Callaghan IgA
antikorlarının APS tanısında önemli rol oynamadığını rapor etmişlerdir. Bu çalışma
da bizim çalışmamızda olduğu gibi Yahudi popülasyonunda yapılmıştır.
Klinik semptomların belirli
antikor ve immünglobulin sınıfları ile ilişkisi bulunamıştır. ROC analizleri;
IgM antikorları ile rekürren venöz tromboembolizm, arteriyel oklüzyon veya
bacaklardaki ülserasyonun ile belirgin AUC değerleri göstermesine rağmen,
sensitiviteleri her zaman % 50’nin altında olmuştur.
Aynı şekilde, IgA ve IgM aCL
antikorları veya IgG ab2GPI antikorları ve LAC’ın varlığı arasındaki
ilişki için sensitiviteler % 44’ün altındadır (£ % 44).
Çalışmamızda LAC’ın varlığını
tespit etmek için kullandığımız aktive parsiyel tromboplastin zamanı LAC
pozitif plazmalarda önemli oranda normal bulunmuş olabilir. Bu yüzden LAC’ı
identifiye ettiğimiz yaklaşımımızın LAC pozitif örneklerin prevelansını
olduğundan daha düşük gösterdiğini hesaba katmalıyız.
Bununla birlikte venöz veya
arteryel tromboz ve rekürren fetal kayıplar ile APL-Abs arasındaki ilişkiyi
gösteren bazı çalışmalarla bizim verilerimiz zıttır. Fakat diğer çalışmalar
immünglobülin izotipleri ve APS’nin klinik belirtileri arasındaki veya APL-Abs
ve SLE arasındaki ilişkiyi bulamamıştır. Bu paradoks, APS’nin kendi içindeki
değişkenliğini, farklı ölçüm metotlarındaki değişkenliği ve farklı
çalışmacıların sonuçlarını karşılaştırmadaki güçlüğü yansıtmaktadır. Buna göre
kendi çalışma popülasyonumuzdaki heterejoniteyi ve bunun diğer gruplarla
karşılaştırma yapmada engel teşkil ettiğini göz ardı edemeyiz.
Sonuç olarak, analizimiz
aCL ve ab2GPI
antikorlarının APS için uygun tanısal belirteç olduğunu göstermektedir.
(Ticari testlerin tanısal doğruluğunda belirgin farklılıklar olmasına rağmen).
Bugün, APS tanısına yönelik fosfolipid antikorları için tekrarlayan testler
yapılması önerilmektedir. Buna karşın bizim analizimizde APS’nin klinik
varlığının tespiti için, IgA veya IgM aCL veya ab2GPI
antikorlarının hedeflendiği tek testin başarılı bir doğruluk sağlayacağı öne
sürülmektedir. Bu yüzden, kesin istatistiksel prosedürlerle yapılacak bundan
sonraki çalışmaların farklı etnik popülasyonlarda klinik baz alınarak
yapılmasını öneriyoruz. Böylece testlerin tanı için gerçekten rutin olup
olmayacağı anlaşılır.
|
|
|
|
