Hazırlayan: Dr.Birşen Bilgici

 

APOPTOZİS

 

          Yüksek organizmalarda  hücre ölümü iki farklı mekanizma ile gerçekleşir. Klasik hücre ölümü  nekroz olarak adlandırılır.Şiddetli bir travma, zararlı bir uyarı ile meydana gelir. Genellikle gruplar halinde hücreleri etkiler.Morfolojik olarak  ER, mitokondride dilatasyon, plazma membranının iyon transportunun bozulması,hücrelerin şişmesi ve lizisi tipiktir.Nükleer kromatin flokulasyonu, DNAnın  nonspesifik klavajı, hücrelerin parçalanması ile hücre içeriği ve lizozomal enzimler eksrasellüler ortama dökülür.Bu enzimlerde komşu hücre ve dokuları zedeleyerek inflamatuar yanıta yol açar.

         Hücre ölümünün  diğer şekli  Apoptosis  genellikle tek tek hücreleri etkiler.Birçok  fizyolojik ve patolojik koşulda ortaya çıkar ve genellikle inflamatuar yanıt söz konusu değildir. Müllerian kanalın ve interdigital perdelerin  regresyonu, B ve T hücrelerin negatif seleksiyonu, self antijenleri  tanıyan immunkompetan  hücrelerin  delesyonu, hormon bağımlı dokuların, hormon yokluğunda involusyonu gibi birçok fizyolojik olayda rol  alır.

          Apoptosis, hücrelerin öldürülmesinde fizyolojik bir süreçtir.Çok hücreli organizmaların gelişimi, işlevselliğinde çok önemlidir. Bu hücre ölümünün kontrolündeki anormallikler :

                                            --Kanser

                                            --Otoimmun Hastalıklar

                                            --Dejeneratif Hastalıklar      oluşumuna neden olur

         Organizmanın bütünlüğü ve homeostazisi, hücre çoğalması ve farklılaşması yanısıra, hücre ölümü ile sağlanabilir.

         Apoptosis sinyallenmesi ya hücre içinden gelen tetikleyici olaylar yada ölüm reseptörlerinin ligasyonu gibi hücre dışındaki olaylarla olur.Tüm apoptosis sinyalleyici yollar, proteinleri aspartat rezidülerine bölen, sistein proteazlar (Kaspazlar) ile olan ortak hücre yıkımı işleminde birleşir.Doku transglutaminaz aktivitesi  ise proteinlerin çapraz bağlanmasına yol açarak intrasellüler yapıların ekstraselüler alana dökülmesine engel olur. Ölü hücrelerin yıkımı ve uzaklaştırılması, komşu hücrelerin fagozitozu ile olur.    

 

         Apoptosisdeki  Morfolojik  Değişiklikler:

 

         Elektron mikroskobunda apoptosis esnasında;

         -Kromatin kondansasyonu

         -Stoplazmik büzülme

         -Plazma membran kabarması

         Apoptosis erken safhasında ER, mitokondri, golgide gözlenebilir değişiklikler olmadığı gösterilmiş olmakla beraber son zamanlarda, mitokondri dış membranında şişme, mitokondrial membran aralıgında sitokrom c ve bir oksidoredüktaz ile ilişkili flavoprotein olan Apopitos İndükleyici Faktör salınımı olduğu bildirilmiştir. Apoptosis esnasındaki moleküler degişiklikler arasında ;                   

         -DNA ayrılması

         -İç ve dış plazma membran yaprakları  arasında PS dağılımının randomizasyonu vardır.             

         Bu değişiklikler;

         -DNA kırılmasında,nukleotitlerin terminal deoksinükleotidil transferaz yolu ile belirlenmesi,

         -PS in annexin ile boyanması ,

         -Subdiploid DNA içeriği olan hücrenin, DNA ekleyen boyalar ile belirlenmesi ile gösterilebilir.

         Apoptosisdeki  Major  Oyuncular:

         1-Kaspazlar

         2-Kaspazların başlatıcı etkinliğini kontrol eden Adaptor Proteinler

         3-TNF-R

         4-Bcl-2 proteinleri

 

 

KASPAZLAR:

İnisiatör K.             Efektör K.             Cytokin Maturasyon 

Ced-3                      C-3                        C-1     C-13

C-2                          C-6                        C-4     C-14

C-9                          C-7                        C-5

C-10                                                      C-11

C-8                                                        C-12

 

         Bir grup sistein proteaz enzimidir. Apoptosis için gereklidir. Kaynağına yada ölüm uyaranına bakılmaksızın apoptosise giden tüm hücrelerde sistein proteaz aktivitesi tespit edilir. Basulovirus protein P³⁵, tüm kaspazların potent inhibitörüdür.

         Kaspazlar, apoptosisin son devresindeki hücresel substratların degradasyonundan sorumlu olduğu gibi apoptosisin başlatılmasında da kritik önemi vardır.Memelilerde en az 14 kaspaz vardır.Bunlar tetrapeptit motifleri tanır ve substratı, bir aspartat rezidüsünün karboksil tarafından ayırır.

         Kaspazlar, düşük intrensik etkinlik gösteren zimojenler olarak sentezlenir.Aktif enzim, 20kD luk subünite ilaveten 10kD luk subünit bulunan bir heterotetramerdir.

         Kaspaz 8  ve  Kaspaz 9,  baslatıcı kaspazlardır ve efektör kaspazların aktivasyonunu başlatır.Bazı kaspazlar ise self processingdir.

 

          Efektör kaspazlar;-DNA onarım enzimleri

                                       -Lamin

                                       -Gelsolin

                                       -MDM2(P⁵³inhibitörü)

         -Protein Kinaz Cd ,    gibi yaşamsal proteinleri  ayırmakta ve inaktive etmektedir.Kaspaz yollu proteoliz ile aktive olan enzimlerde vardır.Kaspaz yolu ile aktifleşen DNAase (CAD) normalde bir inhibitöre İCAD(DNA fragmantasyon faktör) a bağlanarak inaktive olmaktadır.Apoptosis esnasında İCAD kaspazlar tarafından ayrılmakta ve bu durum karekteristik internükleozomal DNA  ayrılması oluşturur. Aktif endonükleazın salınmasına yol açar.                                                           

                                                                                                                                                                                                                                                                                ADAPTÖR  PROTEİNLER:

Adaptor proteinler: Apaf-1

                                Ced-4

                                RAIDD

                                FADD/MORT₁

                                RIP

                                FLIP₁

 

-Hücre  ölüm efektörleri,

-Hücre ölüm regülatörleri,

-Ölüm reseptörleri,

-Bcl-2 gen ailesi ,   arasındaki bağlantıyı kurarlar.         

         Kaspazlar, TNF-Rleri ve Adaptör Proteinler arasındaki  bağlantılar, ölümsahası(DD), ölüm effektör sahası(DED) ve  Kaspaz Toplama sahası(CARD) olarak bilinen alanlar arasındaki homotipik etkilesimler yolu ile sağlanmaktadır. DD içeren  bir TNF-R üyesinin adaptör proteini çapraz bağlanmasından sonra TNF-R’nin  DD ile adaptör proteinin DD i  arasındaki  homotipik etkileşimler, kaspaz agregasyonuna ve aktivasyonuna izin verir. Kaspaz toplanması ve birikimi adaptör proteinlerde bulunan başka bir alan olan DED yolu ile  de olur. DEDler FADD ve Kaspas 8 de de vardır. Bu nedenle CD95in  çapraz  bağlanması  prokaspaz 8,  agregasyonu ve FADD yolu ile aktiflenmesi sonucunu doğurabilir.

DR ®FADD®Kaspas 8,   sinyallenmesi , FLİP molekülleri ile bloke edilebilir. FLİP molekülleri prokaspaz 8 in toplanması ve aktiflenmesini önlemektedir. FLİP in, FLİP_L ve FLİP_S   şekilleri vardır. FLİP_L daha yaygındır ve  prokaspaz 8 e çok benzer.FLİP_S ise sadece iki DED içerir.

         Bütün kaspazlar TNF-R çapraz bağlanma yolu ile aktive olmadığı gibi bütün başlatıcı kaspazlar DED içermezler. Memeli prokaspaz 9 ve prokaspaz 2 ve C.elegans Ced-3 ü  aynı zamanda kendi spesifik adaptörü olan Apaf-1 ve Ced-4 te bulunan CARD ler içerir. Kaspaz 8, CD95 yoluyla aktive olurken, Kaspaz 9 Apaf-1 ile aktive olur ve Bcl-2 proapopitotik üyeleri ile kontrol edilir.

 

TNF-R  AİLESİ:

TNF-R₁

CD95

DR3

CAR₁

DR₄

DR5

NGFR_p75

                 TNF-R üyelerinin pleotropik etkisi vardır. Hücre tipine ve aldığı sinyallere göre proliferasyon ,canlı kalma, farklılaşma yada ölümü tetikleyebilir. Bu reseptörler, TNF ligant ailesine  ait ligantlar tarafından aktive edilir. Bu bağlar memrana bağlanmış trimerler olarak sentezlenir, sinyalleme için çok miktarda çapraz bağlanma gerekir.

         TRAİL/APO-21(TNF ile ilgili apoptosis başlatıcı ligant), Apoptosisi transforme hücrelerde başlatır ve diğer ligantlara kıyasla dokularda daha yaygındır. TRAİL in 4 reseptörü tanımlanmıştır: DR₄ , DR₅ , DCR₁ ,DCR₂ . Fakat sadece DR_{4 ,}DR₅  apoptosisi başlatır. Diğerleri, intrasellüler ve transmemran  bölgeleri yada DD bölgeleri içermediginden apoptosisi başlatamazlar. Bu reseptörler tuzak vazifesi görür. Akciğer ve kolon kanserinde  Fasl (DCR₃) ye karşı  bir tuzak reseptörün çok fazla olduğu  gösterilmiştir.

         Spesifik kaspaz inhibitörleri ve kaspaz eksikliği  olan mice’ların fibroblastlarında yapılan deneylerde,  kaspaz 8 in , DR₄ , DR₅  ve DR₃ ile oluşan apoptosis  için şart olduğunu göstermiştir.

 

BcL-2  ÜYELERİ:       

Antiapoptotik                                         Proapoptotik

Bcl-2                                                       Bax

Bcl-xl                                                     Bod

Boo                                                         Bcl-xs

Bcl-w                                                        Bid                                                                                        

 A₁                                                                                            Bim

Mcl-1                                                      Blk    

                                                Bak

                                                                                                                                                   

         Antiapoptotik Bcl-2 üyeleri, a.a sıraları en az üç dört bölgede benzerlik gösterir. Bcl-2 ye benzerlik gösterirler. Proapoptotik Bcl-2 lerin hepsinde BH₃ bölgesi vardır. Antiapoptotiklerde  bu bölge yoktur.

         Bcl-2 proteinlerinin, transmembran bir  C terminali   vardır. Bu alan nükleer membran, mitekondri dış membranı, ER membrannın sitozolik tarafında yer alır. Bunlar etkileşim bölgeleridir. Bu bölgeler bazılarında sabit iken bazılarında degişebilir. Örneğin, Bax sitozolik bir proteindir, apoptosisde mitokondrial membrana redistribsiyonu olur. Antiapoptotik   Bcl-2 üyeleri kaspaz aktivasyonunu önleyerek antiapoptotik etki gösterirler. Proapoptotik Bcl-2ler sinyalleri adaptör proteinlerde yoğunlaştırır, adaptör proteinler ölüm teşvik edici protein kompleksi Apoptosom un  tam bileşimidir.       

 

 

                       

Memelilerde,efektör kaspazlarin aktivasyonu iki farklı mekanizma ile olur;    1-Hücre içinde stresle ortaya çıkan sinyallerle  başlar.

-Timosit ve embriyonik fibroblastlarda,

-DNA hasarında,

-Steroid,Strausporin tedavisinde,

-Büyüme faktörü yoksunluğunda,  oluşan apoptosisler genelde böyledir.

Burada Apaf-1 ve Kaspaz 9, Kaspaz 3, gereklidir. Bcl-2 antiapoptotik proteinleriyle  bloke edilir. Bu ölümler ihmal ölümleri olarak bilinir.                                       2-Apoptotik sinyallerle, CD95 ve TNF-R  yoluyla apoptosis. FADD ve Kaspaz 8 gereklidir. Bcl-2 apoptotik proteinlerle bloke edilemez. Özellikle  lenfositlerdeki  apoptosis  bu yolla olur.

         Aynı hücrede TNF-R ve Bcl-2 tarafından kontrol edilen yolların aynı anda bulundugu gösterilmiştir ve muhtemelen aralarında bir bağlantı olduğu tespit edilmiştir.

         Hücre extraktları ile yapılan çalışmalar, Holocytochrom c, dATP, ATP nin Apaf-1 ile olan Kaspaz 9 aktivasyonunu ilerlettiğini göstrmiştir. Ek larak, Holocytochrom c nin, apoptos altındaki hücrelerde mitekondriden stoplazmaya göç ettiği gösterilmiştir.

         Apoptosis boyunca hücre ölümü bir çok dokuda, hücre diferansiasyonunun farklı aşamasında meydana gelebilir. Apoptosisdeki anormallikler hastalıkların oluşumunda rol alabilir. Antiapoptotik Bcl-2 ekspresyonu fazla olan miceların tümörogenezise eğilimli olduğu gösterilmiştir. Tek başına Bcl-2 daha az onkojendir fakat l-myc ve pim 1 ile sinerjik etki gösterir. Bcl-2 fazla ekspresyonu neoplastik transformasyonda hücrelerin yaşam süresini uzatmada rol alır ve onkojenik kazanılmış mutasyonları kolaylaştırır. Bcl-2 proapoptotik üyeleri tümör supressör    gibi görev yapar.

         Kemoteropatikler ve radyasyon terapisi tm hücrelerinin apoptosisini teşvik eder. Çalışmalar Kaspaz 8 ve Kaspaz 1 dışındaki  kaspazların  ilaçla teşvik edilmiş apoptosis için esansiyel uyaranlar olduğunu göstermiştir. Kaspaz 8 i olmayan  mice  ların  kemoterapiye ve radyoterapiye daha duyarlı olduğu Kaspaz 9 u olmayanların da yüksek derecede dirençli olduğu gösterilmiştir.

         Hücrelerin uygunsuz hayatta kalışları sadece tümörogenezis için geçerli değildir. Bağışıklık sistemi yanıtı hızlı hücre proliferasyonu  ile karekterize edilir. Anormal şekilde uzatılmış aktive lenfosit yaşamı, etkin lenfokin üretimi ve bulundukları ortama korkunç zararları ile sonuçlanır. Transgenik mice’ların  B lenfositlerinde Bcl-2 nin fazla ekspresyonu veya Bim in olmaması, uzamış humoral yanıt ve plazma hücrelerinin patolojik birikimine yol açar(SLE).

         Apoptosis viruslara ve intersellüler diğer patojenlere karşı savunma mekanizması olarak kullanılır. Bu patojenlerin bir çoğu yaşadıkları hücre ölümüne karşı engelleyici mekanizmalar geliştirmişlerdir. Örn:Adenovirus Protein E₁B₅₅ viral replikasyonu sağlarken, hücreninde apoptosisini aktive eder. Bu Apoptosis de iki Adenovirus proteini E₁B₅₅(P⁵³homoloğu),  E₁B₁₉ (Bcl homoloğu) ile bloke edilebilir. Bcl –2 homologlarına ilaveten virusler daha değişik inhibitörler kazanmıştır.

Adenovirus®E_3-14.7 Kaspaz  8 i inhibe eder.

Compox V.®Crm-A Kaspaz 1 ve 8 inhibe eder. İL-1,İNFg,İNFb üretimini inhibe eder.CD₉₅, TNF-R₁ tarafından saglanan apoptosisi engeller.

Pox V.®TNF-R homologlarını kodlar , TNF ve lenfotoksinlerin yaptığı olayları nötralize eder.

Basulovirus ®P³⁵ , bütün kaspazları inhibe eder.

Herpes V.8®Bcl-2 homoloğu ORF-16 ve vFLİP ORF-71(prokaspaz 8 inhibisyonu).

Bircok virus  hem Bcl-2 hem de reseptör aracılı apoptosisi engelleyebilir.