Akaike M, Azuma H, Kagawa A, Matsumoto K, Hayashi I, Tamura K, Nishiuchi T, Iuchi T, Takamori N, Aihara K, Yoshida T, Kanagawa Y, Matsumoto T.

Department of Medicine & Bioregulatory Sciences, University of Tokushima Graduate School of Medicine

Çeviren: Dr. Mehmet UYSAL

Atheroskleroz Hastalarında

Aspirin Tedavisinin Serum Lp(a) Seviyesine Olan Etkisi
Abstract

 

 

Giriş: Serum Lp(a) seviyesinin artışı atheroskleroz için bağımsız bir risk faktörüdür. Daha önce insan hepatosit hücre kültüründe yaptığımız çalışmada, aspirinin apolipoprotein(a) [apo(a)] gen transkripsiyonunu azaltarak Lp(a) üretimini azalttığını gösterdik.

 

Metot: Koroner arter hastalığı olan veya serebral enfarktüs geçiren 70 hastada hem aspirin tedavisinin (81 mg/gün) serum Lp(a) konsantrasyonuna olan etkisini hem de Lp(a)’daki azalma miktarıyla apo(a) izoform tipleri arasındaki korelasyonu karşılaştırdık.

 

Sonuç: Aspirin yüksek Lp(a) seviyesine sahip olan hastalarda (>300 mg/L) Lp(a)’yı başlangıç değerinin % 80’inine kadar düşürmektedir. Aspirinin Lp(a)’yı düşürmedeki bu etkisi izoformların büyüklüğüne bakılmaksızın yüksek Lp(a) konsantrasyonunda düşük konsantrasyona göre (< 300 mg/L) daha fazladır. Yüksek Lp(a) seviyesine sahip hastalarda Lp(a)’daki azalma, hem yüksek moleküler ağırlıktaki hem de düşük moleküler ağırlıktaki izoformlarda Lp(a) konsantrasonuyla pozitiv korelasyon gösterir.

 

Tartışma: Apo(a)’nın aynı izoformlarında sekretuvar etkinlik muhtemelen aynı olduğu için, benzer apo(a) izoformlarına sahip hasta serumlarındaki Lp(a) konsantrasyon farklılığı apo(a) genindeki transkripsiyonel farklılığa bağlıdır. Bu da aspirinin serum Lp(a) seviyesini, apo(a) geninde yüksek transkripsiyonel aktiviteye sahip hastalarda daha fazla düşürdüğüne işaret etmektedir.

 

 

       Lipoprotein(a) [Lp(a)], apolipoprotein (apo) B-100’ün disülfit bağı ile tek ve büyük bir glikoprotein olan apo(a)’ya bağlı olduğu LDL benzeri bir partiküldür. Apo(a) sisteinden zengin protein tekrarları içerir ve bu yapı plazminojenin kringle-4 yapısına benzemektedir. Apo(a)’nın moleküler ağırlığı 300.000 ile 800.000 arasında değişmektedir ve moleküler ağırlık kringle-4 tekrarlarının sayısı ile tespit edilmektedir. Serum Lp(a) konsantrasyonu kalıtımla yakından ilişkilidir. Boerwinkle ve arkadaşları serum Lp(a) konsantrasyonunun, yaklaşık % 90 oranda genetik olarak 6q26-27 kromozomundaki apo(a) geni dizilimine bağlı olduğunu belirtmişlerdir. Özellikle kringle-4 tekrarlarının sayısı Lp(a) konsantrasyonundaki genetik varyasyonun % 78’ini açıklar. Ayrıca apo(a) izoformunun büyüklüğü ile (yani kringle-4 tekrarlarının sayısı) serum Lp(a) konsantrasyonu arasında zıt yönde güçlü bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. Apo(a) plazminojen ile yüksek derecede homoloji gösterir ve plazminojen ile periferal kan hücreleri ve vasküler endoteliyal hücrelerinde bulunan plazminojen reseptörlerine bağlanmak için yarışır. Böylece plazmin üretimi inhibe edilir ve transforming growth faktör B aktivasyonu meydana gelir. Lp(a)’nın bu özelliği fibrinolizisde azalmaya, vasküler düs kas hücrelerinde büyümenin hızlanmasına yol açar. Sonuçta Lp(a)’nın aortadaki atherosklerotik lezyonlarda depolandığı ve köpük hücrelerinin oluşumunu hızlandırdığı gösterilmiştir. Epidemiyolojik çalışmalar yüksek serum Lp(a)’nın, koroner arter hastalıkları ve stroke gibi aterosklerotik hastalıklar için bağımsız bir risk faktörü olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bundan dolayı yüksek serum Lp(a) konsantrasyonunu düşürmek klinik açıdan önemlidir. Buna karşın serum Lp(a) konsantrasyonu yaş, diyet, ekserzis ve çevresel faktörlerden etkilenmeyen ve yukarıda da belirtilen genetik faktörlerle güçlü bir ilişki içindedir ve de etkili ve güvenli bir şekilde yüksek serum Lp(a) konsantrasyonunu düşürmede lipid düşürücü ilaçlara ihtiyaç duyar.

      

       Daha önce yaptığımız çalışmada aspirinin insan hepatosit hücre kültüründe apo(a) mRNA ekspresyonunu suprese ederek apo(a) geninin transkripsiyonel aktivitesini azaltmak yoluyla Lp(a) üretimini azalttığını göstermiştik. Bu çalışmada aterosklerotik hastalarda aspirinin serum Lp(a)’yı azaltıp azaltmadığını araştırdık ve aspirinin serum Lp(a) farklı apo(a) izoformları üzerine olan etkilerini analiz ettik.

 

 

Materyal ve Metot 

 

DENEKLER VE ASPİRİN TEDAVİSİ

 

       Çalışmayı, koroner arter hastalığı ya da serebral infarktüs tedavisi için düzenli olarak kliniğimize başvuran, yüksek serum Lp(a) konsantrasyonuna (> 300 mg/L) sahip 37 Japon hasta (20 erkek ve 17 kadın) ve düşük serum Lp(a) konsantrasyonuna sahip 33 Japon hasta (20 erkek ve 13 kadın) üzerinde yaptık. Tüm hastalara 81mg/gün aspirin verildi. Bu iki grubun klinik özellikleri tablo 1’de özetlenmiştir.

 

Tablo 1. Deneklerin klinik özellikleri.

 

 

 

       Tablo 1’de belirtilen özelliklerde araştırdığımız serum Lp(a) konsantrasyonu dışında hasta grupları arasında belirgin bir farklılık yoktur. Aspirinin serum Lp(a) üzerine olan gerçek etkisini belirleyebilmek için, atherosklerotik hastalığı olmayan plasebo-kontrol hastaları kullandık. Bunun için kliniğimize düzenli olarak kontrole gelen yüksek serum Lp(a) konsantrasyonuna sahip 22 (12 erkek, 10 bayan, 62.3 ± 1.8 yıl)  ve düşük serum Lp(a) konsantrasyonuna sahip 34 Japon hastayı (20 erkek, 14 kadın; yaş, 61.0 ± 1.9 yıl) gözden geçirdik. Anstabil angina, akut myokard infarktüsü, akut serebral vasküler hastalıklar, malignensi, infeksiyon hastalıkları, karaciğer sirozu ya da renal yetmezlikli (serum kreatinini > 20 mg/L) hastalar bu çalışmaya alınmamışlardır. Kardiyovasküler hastalık, hiperlipidemi ya da diabetes mellitus hastalarında yapılan medikasyon bu çalışma esnasında değiştirilmemiştir. Venöz kan örneği aspirin tedavisine başlanmadan önce ve tedaviye başlandıktan sonra da 1., 2. ve 6. aylarda alınmıştır. Placebo-kontrol çalışmasına alınan herbir katılımcı için ise venöz kan, araştırmanın başlangıcında, 1. ve 3. aylarda alınmıştır. Tüm katılımcılardan gerekli olan izin alınmıştır.

 

 

PROSEDÜR

 

       Serum Lp(a) düzeyi ticari olarak bulunan reaktif seti (Chugai Co.) kullanılarak turbidimetrik immünoassay yöntemi ile ölçülmüştür. CV % 10’un altında ve tespit edilebilen en düşük Lp(a) düzeyi 10 mg/L’dir. Total kolesterol, trigliserid, HDL-kolesterol ve kan şekeri enzimatik olarak ölçülmüşlerdir. Apo(a) izoformları immunoblotting yönteminin kullanımına takiben ticari reaktif seti (Sanwa Chemicak Co.) sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide jel elektroforezi ile tespit edilmiştir. Özetle, serum sodium dodecyl ve 2-mercaptoethanol ile muamele edilmiş ardından % 5’lik polyacrylamide jele elektroforez için maruz bırakılmıştır. Nitrosellüloz membrana transferden sonra, apo(a) bandları double-antibody tekniği ile tespit edilir ve histokimyasal boyalar ile görünür hale getirilir. Elektroforetik mobilitelerine göre Utermann ve arkadaşları tarafından apo(a) izoformları F (apoB-100’den daha hızlı); B (apoB-100 ile aynı); ya da S1, S2, S3 ve S4 (apoB-100’den daha ağır ilerlerler) şeklinde kategorize etmişlerdir. Yaptığımız çalışmada apo(a) izoformları olan F, B, S1, S2, S3 ve S4, kringle-4 tekrarlarının sayısı ile (sırasıyla 11-15, 15-19, 19-23, 23-27, 27-31 ve 31-35) uyum göstermektedir. Mölgaard ve arkadaşları apo(a) izoformlarını 2 başlık altında gruplandırılmışlardır.

Yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) izoform grubu: (S3/null, S4/null, S3/S3, S3/S4 ya da S4/S4)

Düşük moleküler ağırlıklı (LMW) izoform grubu: (F, B, S1 ya da S2’nin haplotiplerindeki diğer durumlar)

 

 

İSTATİKSEL ANALİZ

 

       Tüm veriler mean ± SE olarak ifade edilmiştir. Ortalamalar Wilcoxon testi ya da Manny-Whitney testlerinden uygun olanlar kullanılarak karşılaştırılmışlardır. Farklı gruplar arasındaki karşılaştırmada ANOVA ve çoklu uygunluk testleri kullanılmıştır. Aspirin tedavisine başlandıktan 6 ay sonra serum Lp(a) konsantrasyonundaki düşüş ve başlangıçtaki konsantrasyon arasındaki korelasyon lineer regresyon analizi ile belirlenmiştir. P < 0.05 istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

 

 

SONUÇ

 

       Serum Lp(a) konsantrasyonu aspirin tedavisine başlanmadan önce sırasıyla yüksek serum Lp(a)’ya sahiplerde 627 ± 54 ve düşük serum Lp(a) seviyesine sahiplerde 120 ± 13 mg/L’dir (Tablo 1). Şekil 1A’da gösterildiği gibi aspirin tedavisi, serum Lp(a)’yı yüksek serum Lp(a) seviyesine sahip hastalarda belirgin olarak düşürmektedir. (% 88.3 ± % 2.7 başlangıçtaki değere göre 1 ay sonra kaydedilen değer, p< 0.01). Bu hastalarda serum Lp(a) konsantrasyonu tedaviye başlandıktan 3 ve 6 ay sonra sonra sırasıyla başlangıçtaki değere göre % 85 ± %3.4 ve % 81.7 ± %2.6’e düşer. Buna karşın düşük serum Lp(a) konsantrasyonuna sahip hastalarda 6 aylık aspirin alımı esnasında serum Lp(a) seviyesinde belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir. (sırasıyla 1, 3 ve 6 ay sonra % 95.2 ± % 4, % 101.9 ± % 5.7 ve % 96.5 ± % 3, Şekil 1B). Serum total kolesterol, HDL-kolesterol ve kan şekeri gibi bakılan diğer parametrelerde ise 6 aylık aspirin tedavisi boyunca anlamlı bir değişik saptanmamıştır (veriler gösterilmemiştir). Plasebo-kontrol çalışmasında, serum Lp(a) konsantrasyonu gözlem periyodunun başlangıcında yüksek ve düşük Lp(a)’lılarda sırasıyla 623 ± 18 ve 137 ± 19 mg/L’dir. 3 aylık takip boyunca Lp(a) konsantrasyonunda yüksek ve düşük Lp(a)’lılarda belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir. (1 ve 3 aylık periyotlarda sırasıyla yüksek Lp(a)’lı grup için % 103.0 ± 7.7 ve % 103.0 ± 8.7; düşük Lp(a)’lı grup için % 100.6 ± 9.4 ve % 101.1 ± 9.8)

       Şekil 2’de başlangıçtaki ve aspirin tedavisine başlandıktan 6 ay sonraki her bir apo(a) izoformundaki değişiklikler gösterilmiştir. Aspirinin serum Lp(a) seviyesine olan supresif etkisinin apo(a) izoformlarının büyüklüğüne bağlı olup olmadığını tetkik etmek için, aspirin tedavisine başlandıktan sonra,  başlangıçtaki ve 6 ay sonraki serum Lp(a) düzeylerini aşağıda belirtilen 4 grupta karşılaştırdık.

Bu gruplar:

1.)    LMW izoformlu yüksek serum Lp(a)’lı grup (25 hasta, başlangıç Lp(a), 726 ± 69 mg/L)

2.)    HMW izoformlu yüksek serum Lp(a)’lı grup (12 hasta, başlangıç Lp(a), 421 ± 48 mg/L)

3.)    LMW izoformlu düşük serum Lp(a)’lı grup (7 hasta başlangıç Lp(a) 180 ± 42 mg/L)

4.)    HMW izoformlu düşük serum Lp(a)’lı grup (26 hasta başlangıç Lp(a) 104 ± 10 mg/L)

 

       HMW izoform grupları arasında, aspirin tedavisine başlandıktan 6 ay sonra serum Lp(a) seviyesindeki düşüşün yüzdesi yüksek Lp(a)’lı grup da düşük Lp(a)’lı gruba göre anlamlı olarak yüksektir (p<0.001, sırasıyla % 24.6 ± %4.5 vs % 3.2 ± %3.0, şekil 3). Benzer olarak LMW izoform grupları arasında yüksek serum Lp(a) konsantrasyonuna sahip hastalarda anlamlı olarak daha büyük bir düşüş sergilenmektedir (p<0.01). Ek olarak azalmanın yüzdesi HMW izoformlu yüksek serum Lp(a)’lı grupta LMW izoformlu yüksek Lp(a)’lı gruptan daha yüksek olma eğilimindedir. Ancak bu farklılık istatiksel olarak anlamlı değildir.

       Sonuç olarak başlangıç Lp(a) konsantrasyonu ile, aspirin tedavisi sonrası serum Lp(a)’daki azalma arasındaki ilişkiyi izah etmek için, başlangıç Lp(a) konsantrasyonu ile 6 ay sonra Lp(a)’da meydana gelen  azalma miktarını 4 hasta grubunda analiz edildi. Şekil 4’de gösterildiği gibi, HMW izoformlu yüksek Lp(a)’lı grupta (şekil 4A; r=0.818; p<0.01) ve LMW izoformlu yüksek Lp(a)’lı grupta (Şekil 4B; r= 0.511; p<0.01) yüksek korelasyon bulduk. Ancak HMW izoformlu düşük Lp(a)’lı grupta (şekil 4C) ya da LMW izoformlu düşük Lp(a)’lı grupta korelasyon bulamadık (Şekil 4D).

 

 

TARTIŞMA

 

       Yapılan çalışmada, düşük doz aspirin tedavisinin yüksek Lp(a) seviyesine sahip ve koroner arter hastalığı olanlarda ya da serebral infarktüs geçirenlerde Lp(a)’yı anlamlı derecede düşürdüğü gösterilmiştir (başlangıç değerinin göre % 80-85’ine düşer). Yüksek serum Lp(a) düzeyi aterosklerotik hastalıklarda bağımsız bir risk faktörü olduğu için, yapılan çalışmada aspirinin kardiyovasküler hastalıklarda ve strokta trombosit aggregasyonu üzerine çok iyi bilinen etkilerine ek olarak  özellikle yüksek serum Lp(a) seviyesine sahip hastalarda bu yararlı etkilerinin bulunması önemlidir.

 

       Apo(a)’nın üretim hızı başlıca, apo(a)’nın hem sentezini hem de sekresyonunu düzenleyen karaciğer tarafından kontrol edilir. Apo(a)’nın sentezi hepatositlerde apo(a) mRNA’sının ekspresyonuna bağlıdır ve bu da apo(a) geninin transkripsiyonel aktivitesi ile düzenlenir. Yalnızca apo(a) geninde 5¢ flanking regülatör bölgesinin sequence polimorfizmi değil, ayrıca bilinmeyen apo(a) geni sequence varyasyonlarının apo(a) mRNA expresyonunu etkileyen genetik faktörler olduğu gösterilmiştir. Ayrıca apo(a)’nın hepatositlerden sekresyonunun, apo(a) izoform proteinlerinin moleküler ağırlığından da etkilendiği gösterilmiştir.  Moleküler ağırlık da krinkle-4 tekrarlarının sayısı ile tespit edilir. Diğer yandan, küçük apo(a) protein izoformları hücrelerde daha hızlı matürasyona uğradıkları için, bu tür proteinlerin sekresyon hızının da daha yüksek olduğu dikkate alınır. Bu, apo(a) izoformları ile serum Lp(a) konsantrasyonu arasında ters bir korelasyon olduğunu düşündürmektedir.  

 

Hastalarımızı serum Lp(a) konsantrasyonu ve apo(a) izoformlarına göre aşağıda belirtilen 4 gruba ayırdık.

• HMW izoformlu yüksek Lp(a) konsantrasyonlu grup
• LMW izoformlu yüksek Lp(a) konsantrasyonlu grup
• HMW izoformlu düşük Lp(a) konsantrasyonlu grup
• LMW izoformlu yüksek Lp(a) konsantrasyonlu grup

 

Bu sınıflandırma aynı moleküler ağırlıktaki izoformlarda yüksek Lp(a) seviyesine sahip hastalarda apo(a) genindeki transkripsiyonel aktiviteyi düşük Lp(a) seviyesine sahip hastalarla karşılaştırmak için uygundur. Apo(a) proteinlerinin benzer moleküler ağırlıklı izoform gruplarındaki sekretuvar etkinlik muhtemelen aynı olduğu için, aynı moleküler ağırlıktaki izoform gruplarında Lp(a) konsantrasyonu farklılığı, apo(a) genindeki transkripsiyonel aktiviteye bağlı olan apo(a) mRNA’daki ekspresyon hızındaki değişiklikleri gösterir. Bundan dolayı HMW izoformlu yüksek Lp(a) konsantrasyonuna sahip olan grup bu 4 grup arasında en yüksek transkripsiyonel aktiviteye sahip olandır. Aslında, aspirin HMW izoformlu yüksek serum Lp(a) konsantrasyonlu grupta Lp(a) seviyesini daha etkin olarak düşürmekte ve LMW izoformlu yüksek serum Lp(a) seviyesine sahip grupta da fazla miktarda düşürmektedir. Ek olarak yüksek serum Lp(a) seviyesine sahip hastalar arasında aspirin tedavisine başlandıktan sonra serum Lp(a) seviyesindeki düşüşün miktarı hem HMW hem de LMW izoform grubunda serum Lp(a)’nın başlangıç değeri ile koreledir. Bu korelasyon HMW izoformlu yüksek serum Lp(a)’ya sahip grupta en anlamlı düzeydedir. Aspirinin apo(a) geninde yüksek transkripsiyonel aktiviteye ve yüksek serum Lp(a) konsantrasyonuna sahip hastalarda serum Lp(a) seviyesini apo(a) geni transkripsiyonunu azaltmak yoluyla düşürdüğü genel olarak söylenebilir.

 

       Daha önceki çalışmamızda aspirinin insan hepatosit kültür hücrelerinde apo(a) mRNA ekspresyonunu suprese etmek yoluyla apo(a) üretimini azalttığını gösterdik. Aspirin (0.05-5.0 mmol/L) plazmid ile transfekte olmuş apo(a) promotor geni içeren HepG2 hepatoma hücrelerindeki apo(a) geninin transkripsiyonel aktivitesini de düşürdüğü bildirilmiştir. Ayrıca sodyum salisilatın siklooksijenaz-1 enzimini inhibe etmezken apo(a) geninin transkripsiyonel aktivitesini baskıladığı, buna karşın indometazinin siklooksijenaz-1 enzimini inhibe etmesine karşın apo(a) geninin transkripsiyonel aktivitesi üzerine bir etkisi olmadığını da gösterdik. Ek olarak daha önceki deletion analizi çalışmamızda, bilinmeyen bir transkripsiyonel faktörün, apo(a) geninin promotor bölgesindeki negatif regülatör elementlere (nükleotit –30 ve +139) bağlanmasının aspirinin etkisinden sorumlu olabileceğini işaret etmektedir. Önceki çalışmamızda olduğu gibi şimdiki çalışmamızda aspirinin siklooksijenaz enziminden bağımsız olarak matur apo(a) proteinlerinin sekresyonu üzerine supressif etki yerine apo(a) geni transkripsiyonuna etkisi sayesinde Lp(a) seviyesini düşürdüğü sonucuna varılmıştır. Bununla birlikte önceki çalışmamızda kültür ortamındaki aspirin konsantrasyonu, insanlarda düşük doz aspirin alımını takiben ölçülen konsantrasyondan daha yüksektir. Aspirin ve salisilatın karaciğerdeki lokal konsantrasyonu daha yüksek olabilmesine karşın, aspirinin serum Lp(a) konsantrasyonunu in vivo şartlarda hangi moleküler mekanizmayla düşürebildiği henüz açıklanamamıştır.  

 

       Son olarak aspirin serum Lp(a) konsantrasyonunu yüksek serum Lp(a) seviyesine sahip hastalarda potansiyel olarak apo(a) geni transkripsiyonunu azaltarak düşürmektedir. Aspirinin bu etkilerinin doğruluğunu kanıtlama için yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.