Morten Salomo, Peter Gimsing and Lars B. Nielsen

Departments of Hematology and Clinical Biochemistry, Rigshospitalet, University of Copenhagen, Blegdamsvej 9, DK-2100 Copenhagen, Denmark.

 

Çeviren: Dr. Mehmet UYSAL   Abstract

 

BENCE JONES PROTEİNLERİNİN ÖLÇÜMÜ

 

Multipl myelomalı hastaların yaklaşık % 50’si idrarla monoklonal serbest hafif zincirler [Bence Jones Proteinleri (BJPs)] ekskrete ederler. BJP’leri tespit etmede en sensitif metot konsantre edilmiş idrarda immunfiksasyon elektroforezdir. Ancak bu yöntem yalnızca kalitatif sonuç vermektedir. Myeloma tümör kitlesi ile güçlü bir korelasyonu olduğu için BJP’lerini tespit etmek önemli bilgiler sağlamaktadır. Buna göre BJP ekskresyon hızı multipl myelomanın çeşitli klinik skorlamalarına dahil edilmiştir. (Örneğin, classic Myeloma Staging System), Ayrıca günümüzde hastalığın progresyonunu ve tedaviye cevabını takipte de yer almaktadır. BJP tanısal amaçlı düzey tespitinde, evrelemede ve tedavi takibinde, tam remisyonun dokumente edilmesinde istenen spesifik, kesin ve sensitif bir analitik metottur.

 

BJP’nin kantifikasyonunda çeşitli metotlar kullanılmaktadır. En yaygın olan, dansitometreyi takiben konsantre idrarda agarose jel elektroforezidir (bundan sonra referans metot-karşılaştırılan metot olarak verilecektir). BJP konsantrasyonu BJP bandındaki total üriner protein fraksiyonun total üriner protein konsantrasyonu ile çarpılması ile hesaplanmıştır. Bu metotta iyi bilinen iki problem vardır.

Birinci problem bu proteinlerin konsantre etme prosedürü sırasında proteinlerin büyüklüğüne ve yüküne bağlı olarak kaybedilebilmesidir. Sonuç olarak BJP’nin relatif miktarı diğer üriner proteinler ile karşılaştırıldığında konsantrasyon prosedürü sırasında değişebilir.

İkinci problem laboratuvarların total idrar protein konsantrasyonu tespitinde farklı metotlar kullanmasıdır (presipitasyon metotları, protein binding dyes ya da biüret). Total idrar protein konsantrasyonu tespiti yapan metotların çoğunun hafif zinciri ölçebilirliğindeki doğrulukları belirsizdir. Bundan dolayı proteinleri konsantre etmede aynı metotlar kullanılsa bile  ölçülen BJP konsantrasyonu idrar protein tayin metoduna bağlı olarak oldukça farklı olabilir.  Bu varyasyon 4 farklı BJP içeren örneğin analiz sonucuna  göre gösterilmiştir. (numuneler United Kingdom External Quality Assessment Programındaki 170 farklı laboratuvardan elde edilmiştir). Bu analizlerin BJP için CV’leri (United Kingdom External Quality Assessment Ocak, Mart, Mayıs ve Haziran örnekleri için) sırasıyla %30, %65, %68, ve %76 olarak ölçülmüştür  

 

Bu çalışmada BJP kantifikasyonundaki bu zorlukları elimine etmek için uygun metodu geliştirmek ve değerlendirmeyi tasarladık.

 

MATERYAL VE METOT

 

NUMUNELER

 

Rigshospitalet (Copenhagen) Myeloma kliniğinden 29 hastadan toplanan 24 saatlik idrar aliquotları BJP bulunması için seçilmiştir. BJP konsantrasyon ölçümü olağan klinik değerlendirmenin bir parçası olduğu için etik komiteden izin alınmasına gerek görülmemiştir.

à Aliquotların bir kısmı diğer laboratuvarlarca kullanılan referans metodla (karşılaştırılan metot) konsantre idrarda BJP konsantrayonunu tespit etmede kullanılmıştır.

à  Diğer aliquotlar santrifüje edilmiş ve maksimum 6 aya kadar konsantre edilmeyen idrarda BJP’i kantifikasyonu yapılana kadar –20^oC’de saklanmıştır.

à Değişken protein içeriğine ya da osmalaliteye sahip  ek idrar numuneleri  rutin laboratuvardan rastgele elde edilmiştir.

à  İnsan albumini (200 g/L insan plazma albumin; SSI), bovin serum albumini (2000 mg/L; pierce or sigma) ve  >% 96 pür monoklonal k ve l hafif zincirleri idrar BJP’lerinden SCIPAC ile fosfat buffer salinde (PBS; 8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na₂HPO₄, 0.2 g/L KH₂PO₄, pH 7.5) dilue edilerek izole edilmiş ve 4^oC’de saklanmıştır. Dilue edilmiş serilerin konsantrasyonları Hitachi 917 otoanalizörü [turbidimetrik quantification of benzethonium chloride-precipitated proteins (Roche A/S)] ile ayarlanmıştır (ölçülmüştür?).

 

BJP’NİN KONSANTRE EDİLMEMİŞ İDRARDA KANTİFİKASYONU

 

Yüksek rezolüsyonlu agaroz jel elektroforez (HRAGE) üretici firmanın talimatına uyularak Hydragel 15 HR elektroforez gel ile yarıotomatize Hydrasys cihazında çalışılmıştır. Konsantre edilmeyen idrar (10 mL) buffer strip ve jel tabakası ile beraber bulunan aplikatöre koyulmuştur. Elektroforez sonrası (Program 15 HR –30 dakika) cihazın jel-işlemi modülünde jel ayrıştırılmış ve asit viyolet (SEBIA) ile boyanmıştır. Boyanan jel Hyrys Densitometer (SEBIA) ile 570 nm’de skan edilmiş, area under curve (AUC) BJP veya albumin pikine göre dansitometrenin software programı ile rastgele ünitlerde tespit edilmiştir. İnsan albumin dilusyon serilerinin analizi  AUC’lerin kalibrasyon eğrilerini oluşturmak için (vs protein konsantrasyonu?) kullanılmıştır. BJP bandının AUC’si albumin kalibrasyon eğrileri kullanılarak protein konsantrasyonuna çevrilmiştir. Bovin albumini insan albuminine göre % 20 daha fazla boya almaktadır ve buna uygun olarak daha düşük BJP konsantrasyonu hesaplamaktadır.

 

REFERANS METOTLA (COMPARISON METHOD) KONSANTRE İDRARDA BJP KANTİFİKASYONU

 

BJP ayrıca Nova Medical Medi-Lab A/S (Copenhagen, Denmark) ile geniş çapta kullanılan protokole göre de ölçülmüştür. Özetle idrar numuneleri Minicion-B konsantratör (Amicon Corp.) ile ortalama 100 kat konsantre edilmiş, standart agarose jel elektroforezine (Paragon elektroforez cihazında SPE agarose jele-Beckman Coulter) tabi tutulmuş ve Paragon Blue boyası (Beckman) ile boyanmıştır. Jel total idrar proteininin BJP fraksiyonunu değerlendirmek için dansitometrik olarak skan edilmiştir (Apprasie Dansitometre; Beckman). BJP konsantrasyonu; BJP fraksiyonu total idrar protein konsantrasyonu ile çarpılarak hesaplanmıştır. Klinik Biyokimya Departmanında total idrar protein konsantrasyonu yukarıda tanımlanan şekilde Hitachi 917 otoanalizöründe (Roche) ölçülmüştür.

 

IFE (immün fiksasyon elektroforezi)

 

Elektroforez ve immünofiksasyon, Hydrasys cihazında IFE jel ile üretici firmanın talimatnamesine göre ve serbest l ve serbest k zincirlerine karşı spesifik antikorlarla yapılmıştır.

 

SONUÇ

 

HRAGE JELLERİN DANSİTOMETRİK TARANMASIYLA (SCANNINIG) PROTEİN KANTİFİKASYONU

 

Pürifiye edilmiş albuminin dilusyon serileri Sebia’s semiautomated elektroforez cihazında HRAGE’a tabi tutulmuş ve acid violet ile boyanmıştır (Şekil 1A). Jel dansitometrik olarak skan edilmiş (Şekil 1B) AUC albumin bandlarına uygun olarak protein konsantrasyonun fonksiyonu olarak çizilmiştir (Şekil 1C). AUC ile protein konsantrasyonu arasında sınırlı linearite ilişkisi 2000 mg/L’ye kadardır. Her zaman için görülebilir kısmı tespit edebilmekteyiz ve 20mg/L’nin altındaki albumin konsantrasyonunu dansitometrik olarak ölçebilmekteyiz (kantifiye) (Şekil 1A). 2140, 1100 ve 110 mg/L protein konsantasyonlu insan albumin kalibratörlerinin AUC ler için ‘Between jel impresiyonu’ (CV)  sırasıyla %3.1 (n=7), % 5.7 (n=6) ve % 13 (n=7)’dir.

 

BJP’lerinin acid viyolet ile boyalı HRAGE jelde dansitometrik olarak skan edilerek de tespit edilip edilemediği anlamak için, pürifiye k ve l zincirlerini analiz ettik (Şekil 2,A ve B). k hafif zinciri solüsyonunun görünüşteki protein konsantrasyonu Hitachi 917 için 921 ± 18 mg/L (mean ± SE; n = 7) ve insan albuminin kalibratör olarak kullanıldığı HRAGE acid viyolet boyamasında 875 ± 43 mg/L (n = 3)’tür.  Benzer şekilde l hafif zincirinin konsantrasyonu sırasıyla 533 ± 17 mg/L (n = 3) ve 616 ± 43 mg/L (n = 3)’tür. k ve l hafif zincirlerinin solüsyonlarının dilüsyon eğrileri (Şekil 2,A ve B) albumin dilüsyon eğrilerine benzerdir (Şekil 1B).

 

Asit viyolet ile boyalı jeldeki hafif zincirlerin detection limitleri immünofiksasyondaki ile karşılaştırılmıştır (Şekil 2C). İmmünofiksasyon her iki hafif zincirde de en az 10 mg/L konsantrasyonu tespit ederken, asit viyolet boyalı HRAGE jelin detection limiti k zinciri için 20 mg/L ve l zinciri için de 10 mg/L’dir. İdrar osmalalitesi (Şekil 3A) ve idrar total protein konsantrasyonu (Şekil 3B) BJP’lerinin HRAGE-based metotla ölçümünü etkilememektedir.

 

DANSİTOMETRİK SKANNING HRAGE JEL İLE KONSANTRE EDİLMEMİŞ  İDRARDA BJP KANTİFİKASYONU

 

29 idrar örneğinde BJP mevcudiyeti ilk önce immünfiksasyon ile araştırılmıştır. Daha sonra konsantre edilmemiş idrar HRAGE ve asit viyolet boyaya tabi tutulmuştur (Şekil 4A). AUC BJP’ne uygun olarak dansitometrik tarama ile belirlenmiştir. BJP konsantrasyonları albumin kalibrasyon eğrilerinin AUC’leri ile (Şekil 1C) tespit edilmiştir. Bu analiz 23 hasta numunesi için ikişer kez yapılmıştır (Şekil 4B). Bu iki bağımsız çalışma arasındaki (günlük?) CV,  >100 mg/L (n=13) BJP konsantrasyonuna sahip numune için % 8.5 ve  <100 mg/L (n=10) konsantrasyonuna sahip numune için ise % 7 idi. (indicating reproductible protein loading on the gels-jele yüklenen proteinlerin elde edilebilirliğini gösterir).

 

HRAGE ve acid violet boyama ile elde edilen BJP konsantrasyonlarını jel üzerindeki (on-gel) insan albumin kalibratörlerini kullanarak referans metot (comparision metod) ile karşılaştırdık. Yani konsantre idrarda agarose jel elektroforezi ile tespit edilen total idrar proteinindeki BJP fraksiyonunu, total idrar protein konsantrasyonu (Hitachi 917 otoanalizöründe tespit edilmiş) ile çarptık (Şekil 5A). İki metotla elde edilen sonuçlar arasında kısıtlı (close correlation) korelasyon vardır. Ancak HRAGE-bazlı metotta mukayese (referans-comparision) edilen metoda göre % 18 daha düşük BJP protein konsantrasyon elde edilmiştir. Bu farkın referans metodunda (comparision) proteini konsantre etme aşamasında meydana gelip gelmediğini araştırmak için, ankonsantre idrar kullanılan HRAGE-bazlı metotla elde edilen BJP fraksiyonunu total idrar protein konsantrasyonu ile çarptık ve sonucu elde edilen referans metotla karşılaştırdık. Ankonsante idrarda BJP fraksiyonuna dayanan değerler daha yüksek BJP konsantrasyonu verme eğiliminde olmasına karşın   iki metotla elde edilen sonuçlar benzerdir (Şekil 5B).

 

 

TARTIŞMA

 

Bence jones proteinlerinin miktarının tayini için hızlı, kolay ve güvenilir bir metot sunduk. Bu metotla, idrarı konsantre etmeden, 20-2000 mg/L aralığında BJP’lerinin miktarı tayin edilebilir. 2000 mg/L üzerindeki idrar BJP konsantrasyonu PBS ile dilüe edilmelidir. HRAGE bazlı metot, klinik skorlama sistemlerinde belirtilen ihtiyaçları karşılamaktadır. Örnek olarak multiple myelomalı hastaların başlangıç klinik evreleme kriterleri bakımından 24 saatlik idrarda > 4g veya > 12 g BJP ekskresyonu ayrımı yapılması gereklidir. Multipl myelomada cevap, relaps ve progresyonun tanımında, parsiyel cevap için 200 mg/24saat cutt-off değer olarak kullanılır ve diğer cevap tanımlarında BJP’lerinin relatif değişikliklerini içerir. BJP miktarının tayininde kullanılan diğer elektroforez bazlı metotlarla ilişkili 2 major problem, şimdiki metotla elimine edilmiştir. Örneğin; analizden önce, miktar ve metot için standardize edilmemiş ve muhtemelen protein kompozisyonunu değiştiren idrar örneğini konsantre etme işlemine gerek kalmamıştır. Ek olarak, metota göre farklılık gösteren total protein konsantrasyonunun ayrı ölçümü de terk edilmiştir. Bunun yerine, elektroforezde, ticari olarak bulunan albumin kalibratörlerinin seri dilüsyonlarını ve tarama prosedürünü dahil edilmiştir.   

 

Son on yıl boyunca, idrarda monoklonal komponentlerin miktarının tayini için alternatif metotlar geliştirildi. Nefelometrik ve turbidimetrik immünoassaylar sıklıkla kullanılmaktadır. Fakat önceleri antikorlar ve kalibratörler, monoklonal komponentlerin tek ve monotipik antijenik determinantlarını tespit etmek için optimize edilmemişti..

 

Son zamanlarda Bradwell tarafından, bu problemleri çözen, serum ve idrarda serbest k ve l hafif zincirlerinin tespiti için otomatize edilmiş immünoassay tariflenmiştir. Buna göre, serumda immünglobulin hafif zincirlerinin ölçümü sadece hafif zincir myeloma tanısını koymakla kalmaz, aynı zamanda bazı hastalarda hastalığın aktivitesinin izleminde alternatif bir metot bile olabilmektedir. Kapiller elektroforez yüksek örnek “throughput” (geçişine?) izin verir ve serumda monoklonal komponentlerin tespitinde agaroz jel elektroforezden daha iyi sensitivite sağlar. Kapiller elektroforez, BJP miktarının tayininde de kullanılabilir, fakat böyle bir uygulama belirtilmemiştir. Konsantre edilmemiş idrarın sodyum dodesil sülfat-agaroz jel elektroforezisi konsantre idrarın konvansiyonel nonreducing*?* agaroz jel elektroforezinden daha sensitif olabilmektedir. Bu metodun bir dezavantajı, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılmasıdır. Bu nedenle, BJP’i poliklonal hafif zincirlerden ayrıştırılamamıştır ve bu metotla düşük konsantrasyonda BJP daha yüksek ölçülebilir.

 

Nondenaturating agaroz jel elektroforez ile monoklonal band idendifikasyonu problemli olabilmektedir, çünkü tüm BJP’ler monomerler halinde bulunmaz. Elektroforegramda merdiven benzeri yapıda artış gösterirler. Multipl myeloma sıklıkla renal hastalıkla ilişkili olduğundan, idrarda bazı ekstra proteinler de ekskrete edilir. Bu proteinlerin BJP ile birlikte hareket etmesi, monoklonal piklerin identifikasyonunu ve kantifikasyonunu engelleyebilmektedir. Bu problemler başka yerde tartışıldı(16). Öte yandan, sonuçlarımız göstermektedir ki, HRAGE-bazlı metot BJP’li hastaların rutin değerlendirmesi için uygun olan özelliklere sahiptir.

àİlk özellik, analizlerin yüksek oranda tekrar edilebilir olması (Şekil 4B),

àikincisi, k ve l hafif zincirlerinin ve albuminin AUC-vs-protein konsantrasyon dilüsyon eğrilerinin lineer olması,

àüçüncü özellik ise, BJP konsantrasyon ölçümlerinin, total idrar protein konsantrasyonundan veya idrar osmalalitesindeki farklılıklardan etkilenmemesidir (Şekil 3).

 

HRAGE-bazlı metodun doğruluğunu test etmek için, sıklıkla kullanılan bir metotla karşılaştırdık. HRAGE-bazlı metotla elde ettiğimiz sonuçlar karşılaştırdığımız metotla elde ettiğimiz sonuçlardan % 18 kadar daha düşüktü. Bu farklılığın çeşitli açıklamaları vardı. Bu farklılığın, karşılaştırma yapılan metottaki idrar konsantrasyon basamağı boyunca non-BJP’lerinin selektif kaybından kaynaklanacağını düşündük. HRAGE-bazlı metotta veya karşılaştırma yapılan metotta konsantre idrar analiziyle elde ettiğimiz total idrar proteinlerinin BJP fraksiyonlarından, BJP konsantrasyonlarını hesapladığımızda sonuçların korele olduğunu gördük. Bu da farklı sonuçların konsantrasyon basamağı boyunca non-BJP kaybını yansıtmadığını göstermektedir. İlginç olarak bu sonuçlar, BJP fraksiyonunun HRAGE-bazlı tayininin karşılaştırma yapılan metottaki konsantre idrardaki elektroforez işleminin yerini alabileceğini göstermektedir. Çünkü idrarın konsantre edilme prosedürü gereksiz kılınmıştır.

 

Aynı zamanda HRAGE-bazlı ve karşılaştırma yapılan metodun farklı sonuçlarının, insan albumin kalibratörleri ve BJP’ler arasındaki dye uptake farklılıklarını yansıtıp yansıtamayacağını değerlendirdik. HRAGE-bazlı metot veya otomatize total idrar protein kantifikasyon metodu ile tayin ettiğimiz izole hafif zincir solüsyonlarındaki protein konsantrasyonlarını karşılaştırdığımızda, HRAGE bazlı metotta total idrar protein analizine göre izole k hafif zincir solüsyonu için % 5 daha düşük ve izole l hafif zincir solüsyonu için % 16 daha yüksek sonuçlar bulduk. Bu farklı BJP’ler arasındaki dye uptake farklılıklarını yansıtabilmektedir. Aynı zamanda, otomatik total idrar protein analizi ile elde edilen pürifiye hafif zincir solüsyonlarındaki total protein konsantrasyonu tayinindeki problemleri de yansıtmaktadır. HRAGE-bazlı metot ve karşılaştırma yapılan metotan elde edilen farklı sonuçlar, BJP varlığında total idrar protein konsantrasyonu tayinlerinin doğruluğunun kötü olmasından dolayı karşılaştırma yapılan metotta olan yüksek değerleri yansıtmaktadır. United Kingdom National External Quality Assesment‘in BJP ölçüm programlarında, farklı metotlarla BJP varlığında, total idrar protein konsantrasyonları arasında % 31-53 arasında varyasyon bulunmuştur. Bununla beraber, BJP miktar tayini için mevcut BJP standardı olmadığından ve on-gel insan albumin kalibratörleri ile HRAGE-bazlı metotta farklı laboratuvarla tahminen benzer sonuçlar ortaya çıkabileceğinden, insan albumin kalibratörleri kullanımının BJP miktar tayininde en iyi seçim olduğunu önermekteyiz.

 

Multiple myeloma tedavisindeki ilerlemeler sıklıkla çok merkezli klinik çalışmalara dayanmaktadır. Bu yüzden, plazmada M-komponentlerinin ve idrarda BJP’lerinin miktarının tayininde metot bağımlı varyasyonlar en büyük zorluğu oluşturmaktadır.